Celer® AFLA ELISA test do ilościowego oznaczania aflatoksyn ogółem 96 oznaczeń

Celer® AFLA ELISA - test do ilościowego oznaczania aflatoksyn ogółem, 96 oznaczeń

Celer® AFLA to konkurencyjny test immunoenzymatyczny ELISA przeznaczony do ilościowego oznaczania aflatoksyn ogółem w zbożach, paszach, orzechach, suszonych owocach, nasionach bawełny i wybranych przyprawach.

Zestaw o numerze katalogowym HU0040011 zawiera odczynniki i materiały wystarczające do wykonania 96 oznaczeń, łącznie ze standardami. Krótki czas inkubacji oraz możliwość wykorzystania pojedynczych, odłamywanych studzienek wspierają zarówno analizę większych serii, jak i pracę z mniejszą liczbą próbek.

Test może być wykonywany manualnie z wykorzystaniem czytnika mikropłytek albo automatycznie. Producent potwierdza walidację oznaczenia na automatycznym systemie ELISA The BOLT™.

Kluczowe cechy i parametry techniczne

Matryce przeznaczone do analizy

Celer® AFLA może być stosowany do oznaczania aflatoksyn ogółem w następujących grupach materiałów:

• zboża, w tym kukurydza,
• zarodki kukurydziane,
• pasze,
• nasiona bawełny,
• orzechy, w tym orzechy laskowe i pistacje,
• suszone owoce, w tym figi i rodzynki,
• imbir,
• papryka i chilli.

Sposób przygotowania próbki zależy od matrycy. Nie należy stosować jednego, wspólnego protokołu ekstrakcji do wszystkich produktów.

Zasada działania testu

Studzienki mikropłytki są opłaszczone przeciwciałami skierowanymi przeciwko aflatoksynom. W studzienkach do wstępnego mieszania próbka lub standard są łączone z koniugatem enzymatycznym, a następnie mieszanina jest przenoszona do studzienek reakcyjnych.

Aflatoksyny obecne w próbce konkurują z aflatoksyną znakowaną enzymem o miejsca wiązania przeciwciał. Po inkubacji niezwiązane składniki są usuwane podczas mycia. Następnie dodawany jest substrat chromogenny, który powoduje powstanie niebieskiego zabarwienia.

Po dodaniu roztworu zatrzymującego barwa zmienia się z niebieskiej na żółtą. Absorbancję mierzy się przy długości fali 450 nm. Intensywność barwy jest odwrotnie proporcjonalna do stężenia aflatoksyn: im więcej analitu znajduje się w próbce, tym niższy jest odczyt absorbancji.

Zawartość zestawu

• Mikropłytka do wstępnego mieszania: 96 nieopłaszczonych studzienek – 12 pasków po 8 studzienek
• Mikropłytka reakcyjna: 96 studzienek opłaszczonych przeciwciałami przeciwko aflatoksynom – 12 pasków po 8 studzienek
• Standardy aflatoksyn ogółem: 5 fiolek po 1,5 ml o stężeniach 0, 2, 8, 30 i 80 ppb
• Koniugat enzymatyczny: 14 ml
• Bufor płuczący 10×: 50 ml
• Roztwór wywołujący: 14 ml
• Roztwór zatrzymujący: 8 ml
• Instrukcja wykonania oznaczenia

Studzienki są umieszczone w odłamywanych paskach, dzięki czemu można wykorzystać tylko liczbę potrzebną w danym przebiegu. Niewykorzystane paski należy ponownie szczelnie zamknąć w opakowaniu ze środkiem osuszającym.

Materiały i urządzenia wymagane dodatkowo

• czytnik mikropłytek lub pasków ELISA z filtrem 450 nm,
• pipeta automatyczna 20–200 µl,
• pipeta automatyczna 100–1000 µl,
• pipeta wielokanałowa 50–300 µl,
• jednorazowe końcówki do pipet,
• woda destylowana lub dejonizowana,
• metanol o stężeniu właściwym dla badanej matrycy,
• chlorek sodu,
• waga laboratoryjna,
• młynek lub homogenizator,
• wytrząsarka – opcjonalnie,
• bibuła filtracyjna Whatman nr 1 lub materiał równoważny,
• papier chłonny do osuszania mikropłytki.

Dla zarodków kukurydzianych, pasz i nasion bawełny wymagane mogą być probówki oczyszczające EasypurAFLA. W przypadku papryki i chilli procedura wymaga dodatkowo n-heksanu, PBS, filtra z włókna szklanego oraz kolumny powinowactwa immunologicznego.

Przygotowanie próbek

Producent zaleca stosowanie reprezentatywnej próbki o masie 50 g. Dopuszczalne są również mniejsze porcje dla niektórych matryc, jednak w przypadku nasion bawełny nie należy zmniejszać masy próbki poniżej 50 g. Ekstrakty powinny zostać wykorzystane w dniu przygotowania.

Procedura oznaczenia ELISA

1. Przygotować układ płytki, uwzględniając pięć standardów oraz badane próbki.
2. Do odpowiednich studzienek do wstępnego mieszania dodać po 100 µl koniugatu enzymatycznego.
3. Dodać po 50 µl właściwego standardu lub ekstraktu próbki.
4. Wymieszać zawartość przez trzykrotne pobranie i wypuszczenie cieczy pipetą.
5. Natychmiast przenieść po 100 µl mieszaniny do odpowiednich studzienek opłaszczonych przeciwciałami.
6. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, bez wytrząsania.
7. Opróżnić studzienki i wykonać trzy cykle płukania buforem roboczym.
8. Dodać po 100 µl roztworu wywołującego.
9. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc płytkę przed bezpośrednim światłem.
10. Dodać po 50 µl roztworu zatrzymującego.
11. Zmierzć absorbancję przy 450 nm. Odczyt należy wykonać w ciągu 60 minut od zatrzymania reakcji.

Producent zaleca wykonywanie maksymalnie 48 oznaczeń w jednym przebiegu, wliczając standardy. Jeżeli nie jest używana pipeta wielokanałowa, zalecane jest ograniczenie serii do maksymalnie 16 oznaczeń łącznie ze standardami.

Obliczanie i kontrola wyników

Absorbancję każdego standardu i próbki dzieli się przez absorbancję standardu zerowego B0, a następnie mnoży przez 100. Otrzymana wartość B/B0 jest nanoszona na krzywą kalibracyjną przygotowaną na podstawie standardów 0, 2, 8, 30 i 80 ppb.

Stężenie aflatoksyn w próbce wyznacza się przez interpolację wartości B/B0 z krzywej standardowej. Do opracowania danych można zastosować algorytm spline, metodę punkt–punkt lub regresję liniową, zgodnie z instrukcją i zatwierdzoną procedurą laboratorium.

Producent podaje następujące kryteria kontroli przebiegu:

• absorbancja standardu B0: powyżej 0,7 OD przy 450 nm,
• B/B0 wynoszące 50%: odpowiada zakresowi 6–25 ppb.

Jeżeli parametry kontroli nie spełniają wymagań, wyniki próbek nie powinny być uznawane za ważne. Należy sprawdzić termin ważności, długość fali, sposób pipetowania, czasy inkubacji i skuteczność mycia studzienek.

Zastosowanie

Celer® AFLA jest przeznaczony do profesjonalnej kontroli aflatoksyn w surowcach i produktach spożywczych. Może być wykorzystywany między innymi w:

• laboratoriach kontroli jakości żywności i pasz,
• zakładach przetwórstwa zbóż, orzechów i suszonych owoców,
• wytwórniach pasz,
• zakładach przetwarzających przyprawy,
• laboratoriach usługowych wykonujących seryjne badania mykotoksyn,
• wewnętrznych programach monitorowania bezpieczeństwa surowców.

Krótki czas inkubacji i możliwość zastosowania automatycznego systemu The BOLT™ wspierają analizę większej liczby próbek oraz standaryzację pracy.

Ograniczenia i bezpieczeństwo

• Test oznacza aflatoksyny ogółem i nie różnicuje poszczególnych aflatoksyn.
• Wynik odnosi się do przebadanej próbki oraz zastosowanej procedury ekstrakcji.
• Reprezentatywne pobranie i dokładna homogenizacja próbki mają kluczowy wpływ na wiarygodność wyniku.
• Wyniki przekraczające zakres krzywej wymagają postępowania zgodnego z instrukcją metody.
• Próbki ocenione jako dodatnie powinny zostać ponownie przebadane metodą potwierdzającą.
• Nie należy łączyć odczynników pochodzących z różnych partii zestawu.
• Nie należy wydłużać czasu inkubacji ani prowadzić jej w temperaturze przekraczającej 25°C.
• Roztwór zatrzymujący zawiera kwas siarkowy, a standardy i odczynniki mogą zawierać substancje sklasyfikowane jako niebezpieczne.

Podczas pracy należy stosować właściwe środki ochrony indywidualnej oraz przestrzegać aktualnej instrukcji i kart charakterystyki. Metanol i n-heksan należy stosować wyłącznie w warunkach przewidzianych przez procedurę bezpieczeństwa laboratorium.

Przechowywanie

Zestaw należy przechowywać w temperaturze 2–8°C i nie zamrażać. Wszystkie odczynniki należy doprowadzić do temperatury pokojowej 18–25°C przez co najmniej godzinę przed użyciem.

Opakowania mikropłytek nie należy otwierać przed osiągnięciem temperatury pokojowej. Niewykorzystane paski trzeba przechowywać w ponownie zamkniętym opakowaniu ze środkiem osuszającym. Po zakończeniu pracy odczynniki należy niezwłocznie umieścić ponownie w temperaturze 2–8°C.

FAQ - najczęściej zadawane pytania

Co oznacza określenie „96 det.”?

Skrót „det.” oznacza 96 oznaczeń łącznie ze standardami. Nie oznacza automatycznie możliwości przebadania 96 różnych próbek.

Co wykrywa test Celer AFLA?

Test służy do ilościowego oznaczania aflatoksyn ogółem. Nie rozróżnia poszczególnych rodzajów aflatoksyn.

Jaki jest limit detekcji testu?

Producent deklaruje limit detekcji wynoszący 2 ppb. Granica oznaczalności może zależeć od badanej matrycy i zastosowanej procedury przygotowania próbki.

Jak długo trwa oznaczenie?

Łączny czas inkubacji wynosi 15 minut: 10 minut reakcji konkurencyjnej i 5 minut wywoływania barwy. Czas przygotowania próbki, pipetowania i mycia nie jest wliczony.

Jakiego czytnika wymaga test?

Do odczytu wymagany jest czytnik mikropłytek lub pasków ELISA wyposażony w filtr 450 nm. Test może być również wykonywany automatycznie w zwalidowanym systemie The BOLT™.

Ile próbek można zbadać jednym zestawem?

Liczba próbek zależy od liczby wykonywanych serii, wykorzystanych standardów, kontroli i powtórzeń. W każdym przebiegu należy uwzględnić pięć standardów, dlatego 96 oznaczeń nie odpowiada 96 próbkom.

Czy wszystkie próbki przygotowuje się w taki sam sposób?

Nie. Stężenie metanolu oraz dodatkowe etapy oczyszczania zależą od matrycy. Papryka i chilli wymagają bardziej rozbudowanej procedury niż zboża, orzechy lub suszone owoce.

Czy test można zautomatyzować?

Tak. Producent potwierdza, że oznaczenie zostało zwalidowane do pracy na automatycznym analizatorze ELISA The BOLT™.

Potrzebujesz pomocy w dobraniu testu ELISA do oznaczania mykotoksyn lub wyposażenia do odczytu mikropłytek? Informacje na ten temat znajdziesz tu:

Potrzebujesz pomocy w dobraniu metody ekstrakcji, czytnika lub systemu automatycznego? Skontaktuj się ze specjalistą BestLabs: